365bet

0512-66625996-1 crystal@jiemeigroup.com

Western blot常见问题分析(下)

Western blot(WB)是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法。

365bet

Western blot(WB)是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法

具体的实验原理和实验步骤在前几期中已经做了详细的介绍,实验步骤大致分为:蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、蛋白检测。步骤复杂,耗时长,容易出现各种问题,尤其对于新手来说更是一个挑战。为了让大家能够将这个实验做到完美,本期就简单向大家总结归纳了WB实验中常见的一些问题,并给出了解决方案,目的是为了让大家了解WB实验中的注意点和规范操作的必要性,同时也是方便大家在出现问题后能够及时分析出原因,调整实验方案,得到预期结果。          

我们将常见问题总结归纳为背景高、条带形状异常、非特异性条带、没有条带或条带弱4大类。

本期我们接着介绍非特异性条带、没有条带或条带弱这两种常见问题。

一、非特异性条带

365bet

原因分析 建议解决方案
一抗浓度过高 降低一抗稀释浓度,减少非特异性条带
一抗特异性不高 可更换抗体
蛋白样本降解 提取蛋白时可加蛋白酶抑制剂,全程冰上操作
目的蛋白可能存在多个剪切体 查阅说明书和文献进行参考
一抗不纯,被其他抗体污染 重新配制新的一抗溶液

二、没有条带或条带弱

365bet

原因分析 建议解决方案
一抗/二抗浓度低,时间短 增加抗体浓度,延长孵育时间
一抗/二抗不匹配 确定抗体的种属性
蛋白样本浓度低 增加样本的上样量
蛋白降解 重新制备样品,增加阳性样本对照
转膜不充分,或转时间久了 转膜后染色看转膜的效果,控制转膜的时间和电流
转膜正负极反了 转膜时认真检查装置和转膜夹放置的方向
过度洗膜 要控制洗膜时间,不宜过长
过度封闭 减少封闭时间,或更换封闭液
二抗标记的HRP失效 检查是否使用含叠氮化钠的试剂或容器

从上面的问题分析可以看出在实验过程中会出现很多人为操作上的失误,比如封闭时间、清洗时间、抗体孵育时间的控制;抗体孵育的温度条件;保持膜的湿润等。为了避免这些人为操作所导致实验失败的因素,可以通过使用我司研发的一款AW系列全自动清洗工作站,从封闭到显色之前都可以在这台设备中完成,即可以控制时间和温度,也大大节约了人为参与的时间,降低人为误差,提高实验成功率。

365bet

发布于:2022-04-20
Baidu
sogou