365bet

0512-66625996-1 crystal@jiemeigroup.com

Western blot常见问题分析(上)

Western blot(WB)是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法。

365bet

Western blot(WB)是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法。

具体的实验原理和实验步骤在前几期中已经做了详细的介绍,实验步骤大致分为:蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、蛋白检测。步骤复杂,耗时长,容易出现各种问题,尤其对于新手来说更是一个挑战。为了让大家能够将这个实验做到完美,本期就简单向大家总结归纳了WB实验中常见的一些问题,并给出了解决方案,目的是为了让大家了解WB实验中的注意点和规范操作的必要性,同时也是方便大家在出现问题后能够及时分析出原因,调整实验方案,得到预期结果。        

我们将常见问题总结归纳为背景高、条带形状异常、非特异性条带、没有条带或条带弱4大类,本期我们首先介绍背景高和条带形状异常这两种常见问题。

一、背景高

365bet

原因分析 建议解决方案
膜封闭不充分 延长封闭时间;更换更加合适的封闭液
一抗孵育浓度高 降低一抗稀释浓度,可减少非特异性条带
一抗孵育温度偏高 建议4℃过夜孵育
膜清洗不充分 可适当增加清洗次数和时间
膜在实验过程中干过 整个实验过程中保持膜湿润
曝光时间过长 根据条带背景,适当减少曝光时间
转膜液,封闭液等不新鲜或可能被污染 现配现用

二、条带形状异常

365bet

微笑条带

365bet

皱眉条带

365bet

哑铃条带

365bet

条带串孔

365bet

竖条纹条带

365bet

条带拖尾

365bet

条带变形

365bet

条带变形

365bet

条带上有白色圆圈

365bet

条带反白

条带类型 原因分析 建议解决方案
微笑条带(︶) 电泳电流不均一 需更换电泳槽或两边的边缘孔不加样本
凝胶冷却不均匀 重新配制凝胶
电泳速度过快 可减少电压等减慢电泳速度
转膜温度过高 可在冷室或者冰浴中进行转膜
皱眉条带(⌒) 可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全 可通过调整装置来避免该问题
哑铃条带 SDS-PAGE胶配制时凝固的不均匀 需要重新配胶
样品可能含有过多杂质 样品使用前对其进行离心,以去除过多杂质
条带串孔 上样量高 需降低上样量
制胶问题,分离胶和浓缩胶之间有间隙 重新配胶
竖条纹条带 上样样品中存在不溶性颗粒 上样前离心去除颗粒
膜上的黑点和黑斑可能是封闭液溶解不完全或是封闭液放置过久 过滤封闭液或者更换封闭液
条带拖尾 一抗浓度高,孵育时间久 降低一抗浓度和孵育时间
蛋白浓度高 降低上样量
样品溶解不好 重新溶解样品,上样前可离心,优化蛋白提取的方法
电泳液、转膜液使用次数过多 现配现用
蛋白样品降解 提取蛋白是可加蛋白酶抑制剂,全程冰上操作
分离胶浓度大 根据目的蛋白分析大小,选择合适浓度的分离胶
条带变形 胶中有气泡或者不溶性颗粒 确保配胶试剂中无杂质
蛋白样品降解 提取蛋白时可加蛋白酶抑制剂,全程冰上操作
条带上有白色圆圈 转膜时出现气泡 在转膜过程中要尽量去除气泡,使膜、滤纸和胶紧密结合
反白条带 一抗浓度过高,二抗上HRP催化活力太强,同时显色底物处于临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白HRP 结合物浓度过高 可降低一抗和二抗浓度,或者更换底物
发布于:2022-04-15
Baidu
sogou